消化实验

饲料的化学成分分析只能说明饲料中各种养分的含量，而不能表明它们能被动物消化利用的程度。动物采食的饲料经消化后，从理论上讲，凡是被消化吸收进入体内的养分，只要数量和比例与动物所需完全一致，其利用率应当为100%。但实际上总有一部分营养物质(一般占食入总量的20-30%)不能被吸收，随同消化道分泌物和脱落的肠壁细胞以粪便的形式排出体外。因此，准确测定饲料或饲粮中可消化(可利用)养分的含量具有重要意义，也是评定饲料营养价值的重要方法。

一般将被吸收的养分占食入养分的百分比定为消化率。计算消化率的公式参见本书第二章。养分及能量消化率的测定是通过消化实验来实现的。随着营养学研究的深入, 消化实验也不断改进完善。目前消化实验的内容可用图示(图12-1)剖析说明。考虑营养物质或能量吸收后，一部分经过体内代谢时，从尿中排出，因此，在消化实验的基础上，再增加尿液的收集，测定尿中排泄的养分和能量，即称代谢实验，一般用于饲料的代谢能或养分的代谢率的测定。由于代谢实验只是在消化实验的基础上增加尿液的收集和分析，其它类似消化实验，故不再专门介绍。

体内消化实验

用动物测定饲料养分经过其消化道后的消化率常称体内(in vivo)消化实验。体内消化实验通常分为全收粪法(常规法)和指示剂法。因收粪的部位不同，全收粪法又可分为肛门收粪法和回肠末端收粪法。指示剂法也可分为内源指示剂和外源指示剂法，进一步仍可分为肛门收粪和回肠收粪。

(一)全收粪法

1. 肛门收粪法 传统消化实验都是从肛门收集动物的全部粪便。 其方法、步骤是：

(1)实验动物的准备和要求 一般选择健康有代表性的动物，如对性别无特殊要求，常选用公畜，便于粪尿分开。一般可采用拉丁方设计，每测一种饲料，实验动物不得少于3头，一般以4-5头为宜。动物过少，测值代表性差；动物过多，测值准确性虽略有提高，但费用和工作量都增加。测定禽饲料氨基酸的消化率，由于个体间差异大，一般要求16-24只，但为减少测定氨基酸的样品数，可3-4只为一组，测其混合粪样的氨基酸。

(2)测试饲料和饲粮的准备 用于测试的饲料要一次备齐，按每日每头饲喂量称重分装，并取样供分析干物质和养分含量用。按消化实验的目的配制全价的待测饲粮。日饲喂量以动物能全部摄入为原则，一般为体重的3－5％。体重愈大，饲喂量占体重的比例愈小。

(3)实验步骤 实验分预备实验和正式实验两个阶段。预备实验的目的是让动物适应实验饲粮，排空肠道原有的内容物，同时也熟悉动物的排粪规律，了解采食量。一般成年体重较小的动物以及幼龄动物的消化道排空快，实验时间较短。正式实验期收集粪便的天数以偶数为好，可避免动物排粪一天多一天少带来的误差。

由于有相当一部分饲料，如粗纤维含量高的砻糠，适口性差的菜籽粕及体积大的青绿饲 料，在测定其消化率时，动物很难采食够实验规定的量。所以，按常规法测定其养分及能量消化率时，一般采用顶替法，又称套算法。此法是先配一个正常的基础饲粮，测其消化率，然后用被测饲料顶替基础饲粮的20－30％，再测其消化率。对适口性不好或喂多了有毒害的饲料，可少顶替一些，但不能低于15％。被测饲料某养分或能量的消化率可按下式计算：

100(A-B)

D(％)＝──── ＋B

F

式中：D为被测饲料养分消化率，A为基础饲粮养分消化率，B为顶替后混合饲粮养分消化率，F为被测饲料养分占混合饲粮该养分的比例。

(4)粪的收集和处理 一般是用公畜进行实验，可在动物尾部系一集粪袋收集粪便。对于不宜采用收粪袋的动物可用消化柜或消化栏，实验动物的位置相对固定，使排出的粪能落在集粪盘或清洁的地面上，再收入粪桶。每天定时收集粪便并称重，混匀后按总重的1/10-1/50取样，然后每100克鲜粪加10%的盐酸10毫升，以避免粪中氨氮的损失。

2. 回肠末端取样法 此法是通过外科手术在回肠末端安装一瘘管收集食糜，或施以回─直肠吻合术，在肛门收集回肠食糜，主要用于猪饲料氨基酸消化率的测定。由于受大肠和盲肠微生物的干扰，从肛门收取粪便所测得饲料氨基酸的消化率偏高(约5－10％)。经大量实验证明，此法比肛门收粪法准确，目前在很多国家已用于猪饲料氨基酸消化率的测定。

对于家禽，由于消化道短，大肠和盲肠微生物影响较小，一般仍采用全收粪法。另一改进的方法是模仿真代谢能的测定，即将动物饥饿36-40小时，强饲相当于体重3－5％的饲料，然后收取36-40小时的粪便。因尿中所含氨基酸很微，一般不超过尿中含氮总量的2%，测氨基酸消化率时可忽略不计。目前也有将鸡、鸭的盲肠切除后，测定饲料氨基酸的利用率。但盲肠切除与否对大多数饲料氨基酸消化率的测值无明显影响，切除盲肠的必要性仍有待进一步证明。

(二)指示剂法 指示剂法的优点在于减少收集全部粪便带来的麻烦，省时省力，尤其是在收集全部粪便较困难的情况下，采用指示剂法更具优越性。用作指示剂的物质必须是不为动物所消化吸收，而且能均匀分布并有很高的回收率。根据指示剂的来源又分外源指示剂和内源指示剂。三氧化二铬(Cr₂O₃)是常采用的外源指示剂。内源指示剂一般采用2molHC1或4molHC1不溶灰分，故又称为盐酸不溶灰分法。

1.外源指示剂法 外源指示剂是加入饲粮中的指示物质。如用Cr₂O₃作指示剂，从预备实验期开始就将Cr₂O₃加入饲粮中混匀饲喂。指示剂法除每日只收集部分粪样外，其它与全收粪法相同。粪样收集期完后将所有收集的粪样混匀，再取样分析粪中营养成分和Cr₂O₃含量。营养物质的消化率用下式计算：

                     饲粮中指示剂含量（%） 粪中养分含量（%）

饲粮营养物质消化率(%)=100-(─────────- × ─────────)×100

                       粪中指示剂含量（%） 饲粮中养分含量（%）

粪的干湿对计算无影响，但Cr₂O₃和营养物质含量必须来自同一粪样。外源指示剂法的缺点是很难找到回收率很理想的指示剂物质。Cr₂O₃的回收率一般在90%以上。为了达到一定的可靠程度，要求指示剂的回收率在85％以上才有效。

2.内源指示剂法 内源指示剂是指用饲粮或饲料自身所含有的不可消化吸收的物质作指示剂，如盐酸不溶灰分。内源指示剂可减少将指示剂混入饲粮(饲料)的麻烦，而且用此法测定饲料消化能和蛋白质消化率与全收粪法无显著差异。但是，由于此方法是测定饲料和粪中的盐酸不溶灰分，粪的收集绝不可污染含有不溶灰分的砂粒等杂质。

二、尼龙袋法

近年来提出的反刍动物蛋白质营养新体系，如美国的可代谢蛋白体系与英国的降解和未降解蛋白体系，都需测定饲料蛋白质在瘤胃的降解率。如采用十二指肠瘘管法测定其内容物的非氨氮和微生物氮，需用同位素进行双重标记以区分瘤胃微生物氮和过瘤胃饲料蛋白氮，难度较大。因此，一些研究者提出了“尼龙袋法”。此法是将被测饲料装入一特制尼龙袋，经瘤胃瘘管放入瘤胃中，48小时后取出，冲洗干净，烘干称重，与放入前的饲料蛋白质含量相比，差值即为饲料可降解蛋白量。目前国际上已普遍采用此法测定饲料蛋白质的降解率。其优点是简单易行，重现性好，实验期短，便于大批样品的研究。需注意的是，尼龙袋的通透性要好，网眼大小要恰当，样品要有一定细度，便于瘤胃液作用而充分发酵。由于饲料的降解速率并不一致，而且受外排速度的影响，在实际测定中，为掌握不同时间的降解情况，往往要测定多个时间点，以分析降解程度与时间的关系。

三、离体消化实验

离体消化实验是指模拟消化道的环境，在体外(实验室内)进行饲料的消化(Incubation)。因常规消化实验和指示剂法都要耗费大量人力、物力和时间。尼龙袋法虽有不少优点，但安装瘘管以及操作仍较麻烦，所以近二十年来离体消化实验发展迅速。按照消化液的来源，离体消化实验可分为消化道消化液法和人工消化液法。这两类方法也常混合使用。

(一)消化道消化液法 用安装瘘管的办法收取小肠液或瘤胃液，在试管中进行孵化。

反刍动物离体消化实验一般分为两步，故名“两步法”。先是用瘤胃液消化，然后再用胃蛋白酶加盐酸进一步消化，洗净残渣，测其各种养分含量或能值。目前一种新的检验方法是通过测定消化过程中甲烷和二氧化碳的生成量来估计有机物质的消化率。直接用瘤胃液消化测定饲料蛋白质降解率也有研究。非反刍动物(猪)离体消化实验也是模拟消化道的消化生理过程，分为二步。第一步是用胃蛋白酶加盐酸溶液消化，然后用小肠液在PH7.0的条件下作进一步孵化。用此法测得的结果与全收粪法无显著差异。有研究报道,在用胃蛋白酶孵化前，先用pH5.8的KH₂PO₄·Na₂HPO₄·淀粉酶缓冲液处理，效果更理想。

安装收取小肠液的瘘管位置，以离幽门1.5-2米处为宜，此处小肠液中酶的活性最高。收取小肠液前，应饲喂日常的全价饲粮，测定结果较符合实际情况。在一些国家，例如日本，已将猪的小肠液（Porcine Intestinal Fluid，缩写PIF）制成冻干粉作为商品出售，但有时效果不理想。

(二)人工消化液法 消化液不是来自消化道，而是采用合成的消化酶，模拟制成消化液。目前主要用于反刍动物饲料消化率以及瘤胃饲料蛋白质降解率的测定。消化率的测定仍分为两步，第一步是用纤维素分解酶制剂加盐酸溶液，第二步仍是胃蛋白酶加盐酸溶液，所以又称为“HCl─纤维分解酶法”。

瘤胃饲料蛋白质降解率的测定主要是采用“尼龙袋技术”。虽有不少离体消化的尝试，但这些方法的准确性和可靠性还有待进一步研究。